肠道菌群扰动与各种疾病有关，并且经常与环境暴露有关，包括抗生素的使用和营养缺乏。非抗生素药物也可能导致肠道菌群的变化，由于缺乏可靠的药物暴露数据以及缺乏密集收集的纵向粪便样本，它们对人体的影响尚不清楚。

在《Cell》的这项研究中，研究人员分析异体造血细胞移植 (allo-HCT) 的癌症患者长期的药物使用数据，并收集了这些患者大量的粪便样本，来研究肠道微生物对体内药物暴露的反应。重要的是，研究人员开发、应用和验证一种新的计算方法来推断药物、微生物组组成和临床结果之间的关系 - 即PARADIGM（parameters associated with dynamics of gut microbiota，与肠道微生物群动态相关的参数）。

1. 数据集

研究人员使用来自纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）的 1,201 名allo-HCT 患者的 9,167 份粪便样本，将 MSKCC 队列分为发现（7,454 个样本；778 名患者）和验证（1,713 个样本；423 名患者）队列（图 1）。

图1. 发现和验证队列的患者选择标准

2. allo-HCT患者微生物动态特征

通过可视化，观察到微生物组损伤的模式，包括 alpha 多样性的丧失和潜在致病菌（如Enterococcus和Enterobacteriaceae）的富集（图 2A 和 2B）。研究人员对发现队列中的微生物数据进行聚类分析，确定了10个不同的微生物群簇（图2C）。

图2. allo-HCT 患者的肠道菌群是高度动态的

Lachnospiraceae和Clostridiales构成健康人类肠道中存在的主要共生类群，通常在簇1-3中观察到，它们还具有高alpha多样性的特征（图 2D-2F）。簇7–10 代表低多样性的“生态失调“状态（图 2D–2F）。肠道由单一细菌生物体控制是严重肠道生态失调的标志。乳酸菌、变形菌和链球菌在第5、8 和9簇样本中高度富集。第 7 和10簇由肠球菌组成-主导的样本，其中第10簇特别富含屎肠球菌（图 2D 和 2E）。这些簇还捕获了allo-HCT 期间肠道菌群的时间动态：高多样性簇1-3 在allo-HCT前很常见，而低多样性状态，尤其是簇 7-10，在allo-HCT 后更为普遍图 2G）。

通过聚簇能够将微生物群落中的复杂变化建模为簇转移概率。在 2,987 (54.5%) 对样本中的两个连续样本中，患者保持在同一簇中（图 2H）。与高度稳定的8-10等主导簇相比，患者不太可能留在连续样本中的高多样性簇1-3。簇alpha多样性与自转移概率之间存在显着负相关，与低多样性簇相比，高多样性簇的稳定性较低。在 2,495 对样本 (45.5%) 中观察到从一个簇到另一个簇的转变。

图2H中可以看出，肠球菌（Enterococcus）高簇10具有特别强的稳定性，该属与 HCT 后临床结果不佳相关。通过回归模型分析，发现Staphylococcus和Erysipelatoclostridium 的相对丰度较高与簇10 稳定性降低有关。另一方面，较高的肠球菌相对丰度与簇10的稳定性增加相关，表明肠球菌的优势导致支持其自身稳定性的正反馈回路。正如预期的那样，抗生素暴露与簇10稳定性的增加有关。在这里使用真实世界的数据表明，药物暴露等环境因素和细菌之间的生态关系都有助于微生物群落的稳定性，特别是在肠球菌的控制方面。

3. allo-HCT 的非抗生素暴露与肠道微生物组成的变化有关

为了研究药物暴露与微生物组簇转变之间的关联，研究人员开发了PARADIGM，这是一种基于逻辑回归模型的计算工具，该模型与一阶马尔可夫链转变相结合。模型利用了高分辨率的每日16S rRNA 测序粪便样本，以推断药物暴露与簇转变之间的关联（图 3A）。

图 3. PARADIGM 预测微生物组特征的变化，例如药物暴露后的属相对丰度和 alpha 多样性 

对于每个集群，定义了两种转换类型：自转换（self transition, 患者留在同一簇中）和吸引子转换（attractor transition，患者移动到给定的簇）。这两个命名传达了关于簇动力学的直观内涵。自转换描述了给定簇保持其当前状态的概率，吸引子转换描述了给定簇在一对每日收集的样本中从除自身以外的任何簇接收转换的概率。

研究专注于发现集中患者通常接触的 62 种药物。为了确定每种药物对自身和吸引子转换可能性的贡献，研究人员使用了弹性网络逻辑回归，其中每种药物的所得系数表明药物与每日簇转换之间关联的方向和大小。

研究确定了药物暴露与簇自身和吸引子转换之间的几种关联（图 3B）。用于经验性治疗中性粒细胞减少性发热的几种抗生素与肠道菌群的深刻变化有关。暴露于美罗培南和甲硝唑（这两者都是抗生素）与向肠球菌高簇10 的转换增加相关，这与之前的报告一致。几种非抗生素药物也与特定的簇动力学相关。暴露于阿瑞匹坦（一种用于化疗引起的恶心的速激肽受体拮抗剂）与向肠球菌高簇10的转换频率增加有关。同样，接触阿片类镇痛剂芬太尼与肠球菌高簇10 的转换频率增加有关。其他药物，如拉贝洛尔和胰岛素，这些药物都是不能靶向细菌的，与肠球菌高簇10稳定性降低有关。总之，PARADIGM 确定了几种非抗生素药物与肠道微生物组变化之间的关联。

之前的研究已经确定了与allo-HCT 的后临床结果具有有益或有害关联的特定细菌。这里通过计算细菌反应评分（bacteria response scores）来将药物-簇关联转换成药物-分类群关联，进而确定药物暴露与感兴趣的临床特征关联的特定分类群（图 3C）。细菌反应评分估计药物暴露与微生物组特征（即类群或 alpha多样性的相对丰度）之间的关联，其中正分数表示与较高的相对丰度或多样性值相关（图 3A）。这里主要关注先前与 allo-HCT 患者结果相关的四种微生物组特征，即Enterococcus, Blautia, Erysipelatoclostridium的相对丰度和alpha多样性。队列中使用的大多数抗生素作为经验性或病原体导向治疗（甲硝唑、美罗培南、氨曲南和头孢吡肟）与Enterococcus的相对丰度增加以及 α 多样性降低相关，这与之前的研究一致（图 3C）。观察到头孢吡肟暴露与Enterococcus的增加有关，部分原因可能是头孢吡肟和其他头孢菌素抗Enterococcus较差。与其他抗生素相比，哌拉西林-他唑巴坦暴露与Enterococcus相对丰度降低以及肠道共生菌（如Blautia和Erysipelatoclostridium）相对丰度降低程度关联更大。总体而言，与alpha多样性保留相关的药物暴露与肠球菌减少相关，反之亦然（图 3D）。

4. 抗生素暴露是亚种动态的有力预测指标

即使在同一属内，几种药物的杀菌谱也具有物种和菌株特异性。在人类肠道菌群中，大多数物种都由一个单一的优势菌株代表。对于感兴趣的三个属中的5个物种，研究人员使用 StrainPhlAn 算法在标记基因多态性的基础上确定了显性菌株的序列特征，并计算了连续患者样本中显性菌株之间基于树的系统发育距离（图 4A，上图）。连续样本中菌株之间的小系统发育距离表明显性菌株收敛，而大的距离表明显性菌株随着时间的推移发散。

图 4. 抗生素是allo-HCT期间菌株遗传收敛的有力预测因子 

对于大多数物种，尤其是 E. faecium，连续样本之间的系统发育距离随着时间的推移而下降（图 4A，中间行）。这种时间模式表明，随着时间的推移，多个物种的种内遗传变异性会减少，并且一个显性亚型会出现。此外，亚型变异性与物种相对丰度呈负相关（图 4A，下排）。这种相关性可能是所谓的“选择性清除（selective sweeps）”的结果，通过相对更好的适应性菌株或由于种群瓶颈导致的变异性丧失，这种情况可能在 allo-HCT 期间发生。这里观察到抗生素暴露是 E. faecium种内显性菌株遗传趋同的重要预测因子（图 4B 和 4C）。

5. 药物-微生物组关联可预测allo-HCT后未来的微生物组轨迹和临床结果

上述的结果表明药物暴露与菌群变化有关，并且根据之前将粪便微生物组成与allo-HCT 临床结果相关联的报告，研究人员接下来探索了单独的药物暴露模式是否可以独立于微生物组数据预测死亡率。使用来自单独的MSKCC 验证队列的药物暴露数据，将患者特异性反应评分（patient-specific response scores）定义为量化微生物组特征对药物暴露的净反应的指标（图 5A）。例如，患者特异性肠球菌反应评分将患者的药物暴露情况转化为肠球菌增殖的相对风险（图 5B）。

图 5. 药物暴露可预测两个不同验证队列中未来的微生物组轨迹和allo-HCT患者临床结果

在两个独立的验证队列中测试了这些患者特异性细菌反应评分与全因和特定原因死亡率的结果：423 名未包括在 PARADIGM 训练队列中的 MSKCC 患者的子集以及142名患者来自杜克大学医学中心的独立队列。MSKCC 验证队列考虑了所有62种药物暴露，而杜克验证队列仅评估了抗生素暴露。

HCT之前的14天（-14天）至HCT之后第14 天（+14天）之间的药物暴露的患者特异性细菌反应评分分别与HCT之后14天（+14天）到45天（+45天）观察到的分类群相对丰度和 alpha 多样性显着正相关，这种相关性在MSKCC和杜克验证队列都有体现（图 5C）。此外，在 MSKCC 和 杜克 验证队列中，药物暴露预测肠球菌增殖较高的患者在allo-HCT后全因和移植相关死亡率的风险增加。具体而言，在 MSKCC 验证队列中，患者特异性肠球菌反应评分也与 GVHD 相关死亡率风险增加显着相关（图 5D）。相反，药物暴露预测 Eryispelatoclostridium、Blautia或alpha-diversity能够保持的患者在 MSKCC 发现和验证队列中全因死亡率风险降低，在 MSKCC 中GVHD 相关死亡率风险降低验证队列（图 5D）。总的来说，这些结果证明了药物-微生物组关联可以预测暴露后肠道微生物组组成的后续变化以及 allo-HCT 患者的临床结果。

总结

这项研究开发了PARADIGM，这是一种确定药物暴露与人类肠道微生物动力学之间关联的计算方法。PARADIGM 的核心是分析肠道微生物成分的离散状态如何对抗生素和非抗生素药物产生反应。尽管其他计算方法主要集中在抗生素上，但该方法通过分析来自allo-HCT患者的每日粪便样本的大型数据集，进一步揭示了许多非抗生素药物与高分辨率微生物动力学之间的关联。

参考文献：

Nguyen CL, et al.  High-resolution analyses of associations between medications, microbiome, and mortality in cancer patients. Cell. 2023 Jun 8;186(12):2705-2718.e17. doi: 10.1016/j.cell.2023.05.007. Epub 2023 Jun 8. PMID: 37295406.